Предшественником этого музея был музей антиквариата, основанный в 1855 году Евстафием Тышкевичем. Как и предшествующее учреждение национальный музей специализируется на истории и культуре великого княжества Литовского. Экспозиция музея была составлена большей частью из польских частных коллекций. После январского восстания 1863 года, Российская империя перевезла большую часть коллекции в Москву, а оставшаяся часть коллекции была переорганизована и инкорпорирована Вильнюсской публичной библиотекой. В период с 1866 по 1914 гг музей и библиотека функционировали совместно, но в 1915 году в ходе первой мировой войны фронт приблизился к Вильнюсу и очередная часть экспозиции отправилась в Россию.
После обретения Литвой независимости в 1918 году был открыт Музей истории и этнографии, коллекция которого основывалась на сохранившемся собрании музея антиквариата и литовского научного общества. В 1919 Вильнюс стал частью Польши. А музей был присоединен к Вильнюсскому университету.
Музей снова стал отдельным учреждением в 1952 г, переместившись на территорию арсенала вильнюсского замкового комплекса.